【备战2023高考】生物专题讲与练——考向28《基因工程及生物技术安全性与伦理问题》全能练（含解析）（全国通用）

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考向28 基因工程及生物技术安全性与伦理问题

1.（2021湖北7 ）限制性内切酶EcoRI识别并切割双链DNA，用EcoRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A. 6 B. 250 C. 4000 D. 24000
【答案】C
【解析】
【分析】限制性核酸内切酶能识别特定的DNA序列，切割特定的位点，在特定的碱基之间切割磷酸二酯键。
【详解】据图可知，EcoRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。
故选C。
2.（2021湖北16） 某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A. 增加模板DNA量 B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度
【答案】D
【解析】
【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。
【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；
BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；
D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
故选D。
3．（2021·全国乙卷高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】（1）EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV
（2）磷酸二酯键
（3）自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
4.（2022·全国乙卷·高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______（答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是______。
【答案】(1)逆转录酶##反转录酶
(2)     特异性核苷酸序列     退火##复性
(3)     曾感染新冠病毒，已康复     已感染新冠病毒，是患者
(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
【解析】
【分析】
PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
(1)
分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。
(2)
PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性。
(3)
某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
(4)
基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。
5.（2021辽宁24） PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。

相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。

【答案】（1）逆转录 （2） ①. EcoRI ②. PvitⅡ ③. T4DNA连接酶 （3）感受态 （4）3
（5）G2/M
【解析】
【分析】分析图中质粒含有多个限制酶切位点，在启动子和终止子之间有三个酶切位点，KpnI在质粒上有两个酶切位点，PvitⅡ酶切后获得平末端。
图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多。
将目的基因导入微生物细胞：Ca2+处理法。
【小问1详解】
利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
【小问2详解】
根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。
【小问3详解】
转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
【小问4详解】
由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。
【小问5详解】
比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
【点睛】本题考察基因工程的知识，需要考生分析质粒的酶切位点，结合目的基因转入的位置进行分析，结合题干中目的基因的大小分析电泳图。

1.限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。

（1）应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
（2）为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。
（3）切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：

3.启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

位置
作用
启动子
位于DNA分子上
RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始
密码子
位于mRNA分子上
决定翻译的开始
终止子
位于DNA分子上
决定转录的结束
终止
密码子
位于mRNA分子上
决定翻译的结束
4.农杆菌转化法分析

（1）构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。
（2）基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，有利于重组质粒的导入。
（3）将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。

1.基因工程的概念


2.基因工程的基本工具 3种工具，其中有2种工具酶
（1）限制性内切核酸酶　限制酶是一类酶，而不是一种酶

【注意】　①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（2）DNA连接酶

（3）载体

3.基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的筛选与获取
①目的基因的获取方法：人工合成目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因


【注意】　①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
（2）基因表达载体的构建——核心
①目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②组成：

③构建过程：

（3）将目的基因导入受体细胞
只有该步骤没涉及到碱基互补配对原则

【注意】　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
（4）目的基因的检测与鉴定


1．（2022·内蒙古·海拉尔第二中学模拟预测）科研人员利用基因工程技术，从长穗偃麦草中获取抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。图中 EcoRⅠ、sacⅠ、HindⅢ和PstⅠ是限制酶切割位点。回答下列问题：

(1)基因工程的核心工作是_______________。
(2)该基因工程操作中，先将Fhb7基因与质粒组装，最好选择_______两种限制酶，再组装35S启动子，最好选择_______两种限制酶。组装后的重组质粒还缺少___________。
(3)利用PCR技术扩增Fhb7基因的前提是_______________，以便合成引物，引物在温度为_________条件下结合到互补DNA链上，然后在_____________的催化下从引物开始进行互补链的合成。
(4)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么这一启示是_______________。
【答案】(1)基因表达载体的构建
(2)     SacⅠ和PstⅠ     EcoRⅠ和SacⅠ     终止子和标记基因
(3)     要有一段已知的Fhb7（目的）基因的核苷酸序列     55~60℃或55℃或50℃左右     Taq酶或耐高温的DNA聚合酶
(4)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
【解析】
【分析】
基因工程：目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
PCR：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③当温度上升到72℃左右时，溶液中的脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(1)
基因工程的核心工作是基因表达载体的构建。
(2)
该基因工程操作中，先将Fhb7基因与质粒组装，最好选择SacⅠ和PstⅠ，再组装35S启动子时，最好选择EcoRⅠ和SacⅠ，可以做到不破坏目的基因和启动子。组装后的重组质粒还缺少终止子和标记基因。
(3)
利用PCR技术扩增Fhb7基因的前提是要有一段已知的Fhb7（目的）基因的核苷酸序列用于设计引物。复性时，引物与模板链结合，温度为50℃左右，接着在Taq酶或耐高温的DNA聚合酶的催化下从引物开始进行互补链的合成。
(4)
艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA将R型菌转化为S型菌，说明DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，为基因工程理论的建立提供了启示。
【点睛】
本题主要考查基因工程、PCR的操作和原理，识记和理解具体操作即可解答。
2．（2022·青海·海东市第一中学一模）黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，其病原菌主要为大丽轮枝菌和黑白轮枝菌。科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因D导入棉花，获得抗黄萎病棉花。图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因，BclⅠ、HindⅢ和BamHⅠ为限制酶。请回答下列问题：

(1)获得碱基序列未知的基因D的方法一般为______。利用PCR技术扩增基因D时，设计引物序列的主要依据是______。
(2)将目的基因D和Ti质粒连接构建重组质粒时，切割Ti质粒应选用的限制酶是______，原因是______；可利用含______的培养基对导入重组质粒的农杆菌进行筛选。
(3)农杆菌能够感染棉花的愈伤组织细胞，与这些细胞可以分泌大量的______有关。种植抗黄萎病棉花在环境保护方面的意义主要表现在______。
【答案】(1)     从DNA文库中获取     与D基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对
(2)     HindⅢ和BamHⅠ     双酶切产生不同的黏性末端，防止自身环化和倒接，保证了目的基因准确插入到T-DNA内部     氨苄青霉素
(3)     酚类化合物     减少化学农药的用量，减少环境污染和对人类的危害，对保护环境有益
【解析】
【分析】
基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
(1)
获取目的基因的方法有从基因文库中获取、人工合成和PCR技术扩增等，但要获得碱基序列未知的D基因，需要通过从DNA文库中获取的方法。设计引物序列的主要依据是与D基因两端的部分核苷酸序列碱基互补配对。
(2)
为了保证目的基因能够插入到T-DNA上，T-DNA上没有BclⅠ的切点，所以不选BclⅠ，T-DNA上有HindⅢ和BamHⅠ的切点，同时D基因两端也分别含有HindⅢ和BamHⅠ的切点，由于双酶切可产生不同的黏性末端，能防止自身环化和倒接，并保证目的基因准确插入到T-DNA内部，故选择限制酶为HindⅢ和BamHⅠ。四环素抗性基因被BamHⅠ破坏，质粒中的氨苄青霉素抗性基因能表达出相关氨苄青霉素抗性，因而可在培养基中加入氨苄青霉素，含有重组质粒的农杆菌能生存。
(3)
农杆菌能够感染棉花的愈伤组织细胞，与这些细胞可以分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌。种植抗黄萎病棉花在环境保护方面的意义主要表现在减少化学农药的用量，减少环境污染和对人类的危害，对保护环境有益。
3．（2022·重庆南开中学模拟预测）目前全球新冠肺炎疫情仍在流行。请回答下列问题：
(1)判断是否感染新冠肺炎病毒常用的方法是对疑似患者进行_____检测（答2种）。
(2)目前，接种安全有效的疫苗是防治新冠肺炎最有效的措施。中国科学家分别从①减毒活疫苗，②灭活病毒疫苗、③重组蛋白疫苗、④重组病毒载体疫苗（通常选用复制缺陷型腺病毒为载体），⑤DNA疫苗、⑥mRNA疫苗六大技术方向推进新型冠状病毒疫苗的设计和研发。上述疫苗成分中含有有活性的病毒的是_____（填序号①～⑥），从疫苗成分的角度分析，⑤比③对冷链运输要求低的原因是_____。
(3)灭活病毒疫苗的制备原理是用各种理化方法灭活病原微生物及其代谢产物，使其丧失_____，但保持病毒的免疫原性，之后再通过纯化等步骤制备出候选疫苗，这种疫苗易于实现_____（填“体液”或“细胞”或“特异性”）免疫且应答效果较好。
(4)新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，其表面的S蛋白是该病毒侵染人体细胞的关键蛋白，科学家欲利用大肠杆菌作为工程菌批量生产S蛋白以制备重组蛋白疫苗。已知Tetτ为四环素抗性基因，LacZ'基因的表达产物能使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色，EcoRI的识别序列为，下图为部分流程图。

从2019-nCoV基因组中分离出的S基因不能直接与质粒重组，其原因是_____，得到的S编码序列片段需要在两端加上_____序列后才能与质粒连接。过程②除了得到重组质粒外，还可能得到另外2种片段大小不一的结合产物，为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应_____。最后，通过抗原-抗体杂交技术检测大肠杆菌是否表达出目标产物。
【答案】(1)核酸和抗原
(2)     ①④##④①     蛋白质空间结构易受温度影响，而DNA热稳定性高
(3)     致病性     特异性
(4)     2019-nCoV的基因为单链RNA，不能直接与DNA相连     -TTAA-     应在培养基加入四环素，筛选白色菌落
【解析】
【分析】
疫苗是将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如抗体等，当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。
(1)
新型冠状病毒感染者体内含有新冠病毒以及机体产生的与新冠病毒特异性结合的抗体，故判断是否感染新冠肺炎病毒常用的方法是对疑似患者进行核酸和抗原检测。
(2)
①减毒活疫苗、②灭活病毒疫苗、③重组蛋白疫苗、④重组病毒载体疫苗、⑤DNA疫苗、⑥mRNA疫苗中减毒疫苗使病毒失去致病性，但保留了原有的增殖能力和免疫原性，有活性，重组病毒载体疫苗是以病毒作为载体，病毒有活性，所以有活性病毒为①④。从疫苗成分的角度分析，⑤为核酸疫苗，③为蛋白质类疫苗，蛋白质空间结构易受温度影响，而DNA热稳定性高，因此⑤比③对冷链运输要求低。
(3)
灭活病毒疫苗经过“灭活”处理后丧失致病性，但保持病毒的免疫原性，其抗原仍能引起机体产生特异性免疫，这种疫苗易于实现特异性免疫且应答效果较好。
(4)
因为2019-nCoV的核酸为单链RNA，获得的基因也为单链RNA，不能直接与双链DNA相连，故从2019-nCoV基因组中分离出的S基因不能直接与质粒重组。据图可知，EcoRI酶切后的黏性末端暴露出的碱基为-AATT，故过程①得到的S编码序列片段两端需要分别加上-TTAA-序列后才能与质粒连接。分析题意可知，质粒上LacZ基因会被EcoR I破坏，质粒上有四环素抗性基因，故为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，可在培养基中加入四环素，则在该种培养基上含重组质粒的大肠杆菌可以存活；又因重组质粒的LacZ基因被破坏，故其不能变成蓝色，为白色，故筛选出白色菌落即可。
4．（2022·广东实验中学模拟预测）人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t-PA。
(1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是_______________。此外，大量获得t-PA基因的方法还有___________________（答出1种）。
(2)高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，原因是________________。
(3)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。（注：如图1表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题：

①以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为___________。已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为___________。
②如图所示，需选用限制酶XmaI和___________切开质粒pCLY11，才能与t-PA改良基因高效连接。与单一酶酶切相比，本操作采用的双酶切方法的优点是___________。
③将连接好的DNA分子导入大肠杆菌，含t-PA改良基因重组DNA分子的细胞应具有的性状是________
A．新霉素抗性且呈蓝色                    B．新霉素敏感且呈蓝色
C．新霉素抗性且呈白色                    D．新霉素敏感且呈白色
【答案】(1)     DNA半保留复制（DNA双链复制）     （化学方法）人工合成、从基因文库中获取
(2)蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性。
(3)     蛋白质工程     AGA     BglⅡ     防止质粒载体（和目的基因）自身环化     C
【解析】
【分析】
目的基因的获取可以从基因文库中提取，可以使用PCR进行扩增获得。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
(1)
PCR是指体外合成DNA的技术，其原理是DNA半保留复制。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪用化学方法直接人工合成，此外还可从基因文库中直接获取。
(2)
根据蛋白质在高温条件下会变性失活，而DNA虽然在高温时会变性，但在低温时又会复性的特征，在在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除其中的蛋白质，从而获得较纯净的DNA模板。
(3)
①天然的t-PA基因控制t-PA蛋白的合成，改良t-PA蛋白需要对天然的t-PA基因进行序列改造，然后用改造的基因作为目的基因让其表达，从而实现对天然蛋白质的改造，题中性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为蛋白质工程，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，根据碱基互补配对原则可推测，改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为AGA。
②目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaI和BglⅡ切割产生的粘性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11 （运载体） 拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶Xma和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一个环节为基因表达载体的构建，其的是让目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，这里用两种不同的限制酶切割质粒的目的是为了使其呈现两种不同的黏性末端分别与目的基因的两个黏性末端连接，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时也可避免目的基因和质粒的自身环化。
③结合 图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏neor（新霉素抗性基因），导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，因而菌落呈现白色，而导入pCLY11质粒的大肠杆菌，既有新霉素抗性，且mlacZ基因也能正常表达，因而菌落呈现蓝色。当然这里作为受体细胞的大肠杆菌应该不具有pCLY11质粒，据此可将成功导入目的基因的大肠杆菌筛选出来。
故选C。

6.(2021山东高考 13)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ）
A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L
【答案】A
【解析】木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
7.（2019·江苏卷，10）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（　　）
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
【答案】A
【解析】哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和细胞器，不能提取到DNA，鸡血、菜花、豌豆、菠菜等都具有细胞核，可以通过不同的方法提取DNA，用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量差异很大，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。

1.DNA的粗提取与鉴定
（1）原理

（2）方法步骤

【注意】①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）实验基础

（2）PCR实验操作步骤

（3）DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
【注意】①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。

5.（2022·河北衡水调研）下列有关电泳的叙述，不正确的是（　　）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
【答案】C
【解析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
6.（2022·山东济南调研）人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8 416 bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。

（1）上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是______________________________________________。
（2）利用PCR技术获取人胰岛素基因，在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有_____________________________________________。
（3）经过　　　　轮循环可以得到所需的目的基因，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A　　　　个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题：___________________________________________、
______________________________________________（答出2点即可）。
（4）利用SDS－凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于　　　　　　　　。
（5）利用图示方法获取的目的基因，直接构建基因表达载体后导人大肠杆菌，
　　（填“能”或“不能”）表达出人胰岛素，理由是_________________________________________。
【答案】（1）从基因文库获取或人工合成　（2）四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶 （3）3　31　引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列　
（4）DNA分子的大小　（5）不能　因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子，而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误
【解析】（3）题图中引物A和引物B在DNA片段内部，根据PCR的过程和DNA分子半保留复制的特点可知，前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即目的基因。其过程图如下：

第一轮：

第二轮：
由①得到的DNA分子如下：

由②得到的DNA分子如下：

第三轮：由①可得

由②可得

从理论上推测，一个DNA分子经n次循环合成的DNA分子为2n个，脱氧核苷酸链数为2n＋1，新合成的脱氧核苷酸链数为2n＋1－2，而每合成一条脱氧核苷酸链需要一个引物，所以共需要消耗2n＋1－2个引物，即25＋1－2＝62个，其中引物A为31个。设计引物时需要注意以下几点：引物自身及引物之间不能有互补序列，以防止自身或相互连接，引物长度适当，引物能与目的基因两侧特异性结合等。（4）在凝胶中DNA分子的迁移速度与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。（5）图示获得的目的基因含有外显子和内含子，因此直接将含有此目的基因的表达载体导入大肠杆菌并不能表达出胰岛素，原因是大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误。

8．（2021·广东高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。

回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】（1）基因文库中获取、人工合成法
（2）盐析法、酶解法或高温变性
（3）感受态 抗原-抗体杂交技术
（4）有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【点睛】
本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。
9．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是_______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有___________、__________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是____________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是______________________________。

(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________________。
【答案】(1)     氨基酸序列多肽链     mRNA      密码子的简并性
(2)     从基因文库中获取目的基因     通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成      DNA双链复制
(3)     种类      提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【解析】
【分析】
1、蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列；
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
(1)
据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。
(2)
蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。
(3)
将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
(4)
若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。

1.基因工程的应用




【注意】①动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
②原核生物的基因（如抗虫基因）可以作为真核生物（棉花）的目的基因。
③乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
2.蛋白质工程　第二代基因工程，可生产自然界中不存在的蛋白质
（1）概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
（2）操作手段和结果

（3）基本思路

3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系


7.（2021·山东威海一模）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不能遗传给子代的是（　　）
A.将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌
B.通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株
C.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
D.将生长激素基因导入奶牛受精卵，培育出能分泌含生长激素乳汁的奶牛
【答案】C
【解析】将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌可以通过二分裂的方式遗传给子代，A不符合题意；通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株，遗传物质发生改变，可以通过无性繁殖遗传给子代，B不符合题意；将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞，只是淋巴细胞含有这个基因，其生殖细胞没有该基因，因此不能遗传给子代，C符合题意；将生长激素基因导入奶牛受精卵，受精卵含有生长激素基因，受精卵培育成的奶牛含有该基因，因此可以遗传给子代，D不符合题意。
8.（2021·山东青岛期中）采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是（　　）
A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目等于凝血因子氨基酸数目的3倍
B.该技术的利用可以定向改变生物的遗传性状，使种群的基因库发生改变
C.在转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【答案】B
【解析】因为真核生物的基因中存在非编码区，而编码蛋白质的是编码区的外显子，并且终止密码子不编码氨基酸，所以凝血因子基因编码区的碱基对数目应大于凝血因子氨基酸数目的3倍，A错误；该技术可以定向改变生物的遗传性状（使转基因山羊的乳汁中含有人凝血因子），使种群的基因库发生改变，B正确；因为目的基因导入受精卵中，而转基因羊的每一个体细胞都是由受精卵有丝分裂而来的，所以转基因羊的所有体细胞都含有人凝血因子基因，C错误；人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板，同时以核糖核苷酸为原料催化合成mRNA，D错误。
9.（2022·山西太原质检）中华鲟是地球上最古老的脊椎动物之一，被誉为“水中大熊猫”。研究者试图利用蛋白质工程技术改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是（　　）
A.该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
B.改造蛋白质是通过改造基因而实现的
C.中华鲟的相关蛋白质被改造的过程同样遵循中心法则
D.改造后的中华鲟产生的后代不具有改造后的蛋白质
【答案】D
【解析】可以通过改造基因来定向改变蛋白质分子的结构，A、B正确；蛋白质工程的设计思路实际上是中心法则的逆推，因此中华鲟的相关蛋白质被改造的过程同样遵循中心法则，C正确；蛋白质工程改造的是基因，可以遗传给子代，因此改造后的中华鲟产生的后代也具有改造后的蛋白质，D错误。
10.（2022·安徽合肥市质检）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是（　　）

A.过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B.构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C.检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D.用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
【答案】C
【解析】过程①构建基因表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；终止子的作用是终止转录过程，B错误；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；采用细胞培养生产EPO成本比较高，可以采用乳腺生物反应器，将基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物，D错误。

10．（2021河北高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

（5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。
【答案】     基因组文库     限制酶和DNA连接酶     便于目的基因的筛选和鉴定     农杆菌转化法     避免目的基因在自然界中的扩散     耐性     茎叶     YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水     杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【解析】
【分析】
1、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，基因组文库包含该物种的全部基因，cDNA文库是部分基因文库。
2、据图1可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加；据图2可知，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型。
【详解】
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
【点睛】
本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。

1.转基因产品的安全性
（1）争论焦点：在转基因食品的安全性等方面发生激烈的争论。
（2）正确态度：理性看待转基因技术要做到建立在完备的相关科学知识基础之上；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
（3）我国方针：研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
2.关注生殖性克隆人
（1）生殖性克隆和治疗性克隆
①生殖性克隆：是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
②治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
（2）我国禁止生殖性克隆人的“四不”原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
（3）警惕用细胞研究和人类基因组编写计划等新技术研究生殖性克隆人。
3.禁止生物武器
（1）生物武器
①种类：病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
②特点：致病能力强，攻击范围广。
③散布途径：直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布。
（2）禁止生物武器
我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。

11.（2021·北京顺义一模）现代生物技术造福人类的同时，也可能引起一系列的安全和伦理问题，下列说法不恰当的是（　　）
A.我国政府不支持任何生殖性克隆人实验
B.我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器
C.只要有证据表明转基因产品有害，就应禁止该技术的应用
D.我国已经对转基因食品和转基因农产品实施产品标识制度
【答案】C
【解析】我国政府禁止生殖性克隆人，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验），但不反对治疗性克隆，A正确；我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器，B正确；对于转基因产品，我们应该客观公正地看待它，有益的推广，有害的禁止，但不能禁止该技术的应用，C错误；我国已经对转基因食品和转基因农产品实施产品标识制度，以尊重人们的知情权和选择权，D正确。
12.（2021·山东百师联盟联考）2018年11月，世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿诞生。这项研究用到了能够精确定位并修饰基因的基因编辑技术，即基因编辑时用约为头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的RNA引导序列注入受精卵中，对CCR5基因进行修改，预期婴儿出生后能天然抵抗人类免疫缺陷病毒，关于该技术的安全性问题，下列说法错误的是（　　）
A.基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果
B.经过基因编辑的个体，有可能影响基因选择性表达，而导致其他疾病的产生
C.将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德
D.只要加强监管、完善法律法规、完善技术手段，不需担心基因编辑技术的安全性
【答案】D
【解析】基因编辑时的引导序列是RNA，RNA的碱基序列改变可能导致识别错误，导致剪切错误，造成不可预知的后果，A正确；基因编辑后，基因的序列发生改变，基因的表达具有选择性，可能会受到影响，基因选择性表达受干扰后，容易导致某些疾病的产生，B正确；生殖性克隆不符合人类伦理道德，治疗性克隆符合人类伦理道德，将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德，C正确；可以加强监管、完善法律法规、完善技术手段，但基因编辑技术仍存在一定的安全性问题，D错误。
13.（2022·福建宁德期末）中国首例设计试管婴儿的父母均为地中海贫血基因的携带者，为了挽救患有重度地中海贫血的姐姐，用他的脐带血帮助姐姐进行造血干细胞移植。下列相关说法正确的是（　　）
A.该婴儿的获得运用了体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植和基因工程等技术
B.移植前需对胚胎进行遗传学诊断
C.姐姐康复后所生的孩子不含地中海贫血基因
D.表明我国已放开设计试管婴儿技术的研究与应用
【答案】B
【解析】设计试管婴儿运用了体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植和遗传学诊断等技术，A错误；移植前需对胚胎进行遗传学诊断，从中选择符合要求的胚胎，B正确；姐姐进行造血干细胞移植没有改变其基因，故姐姐康复后所生的孩子仍含地中海贫血基因，C错误；设计试管婴儿会带来伦理道德问题，我国未放开设计试管婴儿技术的研究与应用，D错误。

1．利用新鲜菜花作为实验材料提取DNA时，下列做法正确的是（       ）
A．可将菜花置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B．离心后上清液中加入95%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA
C．将晾干的白色丝状物置于2mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D．向DNA溶液中加入二苯胺试剂混匀，溶液会呈现蓝色
【答案】C
【解析】
【分析】
DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3、DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】
A、菜花是植物细胞，其细胞壁有保护和支撑的作用，不会吸水涨破，需要用洗涤剂瓦解细胞膜，A错误；
B、在上清液中加入等体积的95%的冷酒精，白色丝状物是粗提取的DNA，B错误；
C、DNA在2mol/L的氯化钠溶液中溶解度较大，所以将晾干的白色丝状物置于2mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象，C正确；
D、DNA在沸水浴条件下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应，D错误。
故选C。
2．下列有关基因工程的叙述，正确的是（　　）
A．目的基因可来自动物、植物或微生物，受体细胞只可来自动物、植物
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达
【答案】C
【解析】
【分析】
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、基因的载体。基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测和鉴定。
【详解】
A、受体细胞可以来自动物、植物或微生物，A错误；
B、限制酶具有专一性，每种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，B错误；
C、选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少，C正确；
D、目的基因进入了受体细胞不一定能成功表达，还需要检测和鉴定，D错误。
故选C。
3．下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　　）
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用体内DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
【答案】D
【解析】
【分析】
PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制。PCR所需条件包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），过程包括：变性→退火→延伸→终止。
【详解】
A、PCR技术的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，而不是目的基因的序列完全已知，A错误；
B、PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，B错误；
C、该过程需要一对特异性的引物，但要求一对引物的序列是不互补的，引物序列需要跟模板互补，C错误；
D、PCR技术的原理是DNA复制，也需要模板、原料、酶等条件，D正确。
故选D。
4．下列关于基因工程及转基因食品的安全性的叙述，正确的是（       ）
A．基因工程经常以抗生素抗性基因作为目的基因
B．通过转基因技术可获得抗虫粮食作物，从而增加粮食产量，减少农药使用
C．通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种限制性核酸内切酶处理运载体DNA
D．质粒是广泛存在于细菌细胞质中的一种颗粒状的细胞器
【答案】B
【解析】
【分析】
目的基因是根据人类的实际需要选取的某一生物决定某一特征的某一特定基因，抗生素抗性基因是标记基因，是筛选微生物时使用的。
【详解】
A、基因工程经常以抗生素抗性基因作为标记基因，A错误；
B、通过转基因技术可获得抗虫粮食作物，从而增加粮食产量，减少农药使用，B正确；
C、通常用同一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA和运载体DNA，C错误；
D、质粒是小型环状DNA分子，不属于细胞器，D错误；
故选B。
5．下列关于基因工程的成果，叙述错误的是（       ）
A．在医药卫生方面，主要用于生产药品和诊断治疗疾病
B．在农业上主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗性的农作物
C．在畜牧业上主要目的是培育体型巨大、凶猛的动物
D．在环境保护方面主要用于环境监测和对被污染环境的净化
【答案】C
【解析】
【分析】
1、植物基因工程的应用：（1）抗虫转基因植物；（2）抗病转基因植物；（3）抗逆转基因植物；（4）转基因改良植物品质。总之基因工程在农业上用于生产高产、稳产和具有优良品质的品种，能产生抗逆性品种。2、动物基因工程的成果：（1）提高动物的生长速度：外源生长激素基因；（2）改善畜产品的品质；（3）转基因动物生产药物；（4）转基因动物作器官移植的供体。3、医药卫生方面的成果：主要是生产基因工程药物，如人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、干扰素等。4、环境保护方面：环境监测和对污染环境的净化。
【详解】
A、基因工程在医药卫生方面的应用主要包括两个方面生产基因工程药品和用于基因工程诊断与基因治疗，A正确；
B、在农业上主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物，B正确；
C、在畜牧养殖业主要是提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物，C错误；
D、在环境保护方面，基因工程主要用于环境监测和对污染环境的净化，D正确。
故选C。
6．蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是（       ）
A．分析蛋白质的三维结构
B．对基因的结构进行分子设计
C．获取编码蛋白质的基因序列信息
D．获得满足人类生产和生活需求的蛋白质
【答案】D
【解析】
【分析】
蛋白质工程是中心法则的逆推。其设计过程为预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，进而实现定向改造或生产人类所需蛋白质的目的。
【详解】
A、分析蛋白质的三维结构是蛋白质工程的准备工作，与题意不符，A错误；
B、对基因的结构进行分子设计是便于人工合成目的基因，这不是蛋白质工程的最终目的，B错误；
C、获取编码蛋白质的基因序列信息实现了对基因的修饰或合成过程，但不是蛋白质工程要的最终目的，C错误；
D、改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，从而获得满足人类生产和生活需求的蛋白质，这是蛋白质工程的最终目标，D正确。
故选D。
7．下图是蛋白质工程的示图，有关叙述错误的是（       ）

A．蛋白质工程流程的顺序是A、B、C、D、E、F、G
B．目前蛋白质工程最大的困难是E过程，即设计预期的蛋白质结构
C．G过程的完成依赖于基因修饰或基因合成
D．实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系
【答案】A
【解析】
【分析】
蛋白质工程的基本流程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。
【详解】
A、蛋白质工程是对天然的蛋白质进行改造，进而生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术，因而蛋白质工程流程的顺序应为E→F→G→A→B→ C→D，A错误；
B、多数蛋白质除具有一级结构（即氨基酸顺序）外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的，因此目前蛋白质工程最大的困难是E过程，即设计预期的蛋白质结构，B正确；
C、蛋白质工程最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成，G过程是目的基因的获取，它的完成依赖于基因修饰或基因合成，C正确；
D、蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，因此实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系，D正确。
故选A。
8．现代生物技术点缀人们的幸福生活，也可能造成安全与伦理问题。下列有关说法正确的是（       ）
A．治疗性克隆的目的用于医学研究和治疗，无需监管审查
B．基因身份证可能造成基因歧视，影响人际关系等
C．利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期培养智力超群的“完美婴儿”
D．为防止生物技术用于生产生物武器，严禁进行生物技术的新研究
【答案】B
【解析】
【分析】
我国政府的态度：禁止生殖性克隆人，坚持四不原则(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验)，不反对治疗性克隆人。
【详解】
A、治疗性克隆的目的用于医学研究和治疗，不反对治疗性克隆人，但仍需监管审查，A错误；
B、基因身份证是指把个人的致病基因和易感基因检测出来，记录在磁卡上，做成个人基因身份证，卡片信息一旦泄露，可能造成基因歧视，影响人际关系等，B正确；
C、利用基因编辑技术设计试管婴儿，以期得到身高标准和智力超群的“完美婴儿”，已经涉及到新生命的诞生，会造成生物技术安全与伦理问题，C错误；
D、生物武器具有强大的传染性和致病力，应在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，但不应严禁进行生物技术的新研究，D错误。
故选B。
9．下图是制备抗埃博拉病毒VP40蛋白的单克隆抗体的过程:

(1)过程①中为了防止自身环化，应该选用的限制酶是______________________ 。
(2)过程②中首先需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于感受态，VP40基因进入大肠杆菌后维持稳定并表达的过程称为________。
(3)与植物原生质体融合相比，过程④特有的方法是用________处理。选择培养基上存活的杂交瘤细胞产生的抗体________(填“是”或“不是”)单克隆抗体。
(4)特异性抗体也可以通过常规方法来制备：向动物反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物的血清中分离所需抗体。与这种常规方法相比，单克隆抗体具有________等优点（答出三点即可）。
(5)图示过程应用的生物技术有____________________（答出三种）。
(6)如图为蛋白质工程的流程图(自右向左)

与基因工程相比较,蛋白质工程产物具备的特点是:_____________________，图中的步骤①为DNA合成、②为_____________。如果已知mRNA的碱基序列是-A-U-C-C-A-G-G-U-C-,合成DNA的对应碱基对序列是__________。
【答案】(1)EcoRⅠ和XhoⅠ
(2)转化
(3)     灭活的病毒     不是
(4)特异性强、灵敏度高、能大量制备
(5)基因工程、动物细胞培养、动物细胞融合
(6)     可生产出自然界不存在的蛋白质     分子设计     -A-T-C-C-A-G-G-T-C-
-T-A-G-G-T-C-C-A-G-
【解析】
【分析】
单克隆抗体制备的两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。单克隆抗体：由单个B淋巴细胞进行无性繁殖形成的细胞系所产生出的化学性质单一、特异性强的抗体。具有特异性强、灵敏度高，并可能大量制备的特点。
（1）据图可知，目的基因和质粒都含有EcoRⅠ和XhoⅠ识别序列，因此过程①中为了防止自身环化，应该选用的限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ。
（2）转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。过程②中首先需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于感受态，VP40基因进入大肠杆菌后维持稳定并表达的过程称为转化。　
（3）诱导植物细胞融合的方法有物理法包括离心、振动、电刺激等，化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂，过程④是动物细胞融合，诱导动物细胞融合除了化学诱导剂之外，还有灭活的病毒处理。选择培养基上存活的杂交瘤细胞产生的抗体不是单克隆抗体，还需要利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，才能获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。
（4）与这种常规方法相比，单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、能大量制备。
（5）据图可知，图示将目的基因与质粒连接，导入大肠杆菌使其表达出VP40蛋白，是基因工程；B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合运用了动物细胞融合技术；杂交瘤细胞在选择培养基上培养，运用了动物细胞培养技术。
（6）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要，因此与基因工程相比较，蛋白质工程产物具备的特点是可生产出自然界不存在的蛋白质。据图可知，过程②根据设预期的蛋白质结构来推测应有氨基酸序列，属于分子设计。如果已知mRNA的碱基序列是-A-U-C-C-A-G-G-U-C-，根据碱基互补配对原则可知，合成DNA的对应碱基对序列是
10．新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是_______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒，PCR技术的原理是_______，该技术需要的一种酶是_______。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的_____来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是_______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_______(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_______，其中核心步骤是___②____，在此过程中需要的工具酶是___。
【答案】(1)     逆转录酶##反转录酶     DNA复制     Taq酶##耐高温的DNA聚合酶

(2)     特异性核苷酸序列     退火复性
(3)     曾感染新冠病毒，已康复     已感染新冠病毒，是患者
(4)     获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）     基因表达载体构建     限制酶和DNA连接酶
【解析】
【分析】
PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，其原理是DNA复制，该技术需要高温解旋DNA，需要一种耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶。
（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。
（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。
（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。其中核心步骤是基因表达载体的构建，在此过程中需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。



1．大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核 DNA 就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用限制酶Ⅰ和Ⅱ处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是（       ）

A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定
C．用限制酶Ⅰ和Ⅱ处理提取产物的电泳结果说明未提取到质粒
D．溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响
【答案】C
【解析】
【分析】
DNA的粗提取和鉴定：利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可以将DNA与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】
A、DNA在冷酒精中溶解度很低，提取DNA时可加入酒精，是为了让DNA析出，蛋白质等物质溶解，A正确；
B、将提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件进行鉴定，B正确；
C、限制性酶Ⅰ和限制性酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；
D、溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，常用于使细胞破碎，D正确。
故选C。
2．如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端均有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列叙述正确的是（　　）

A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
【答案】C
【解析】
【分析】
1、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
2、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
【详解】
A、将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，那么酶切后二者的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有三种，其中只有一种符合基因工程的需求，A错误；
B、DNA连接酶的作用是将酶切后的目的基因和质粒的黏性末端连接起来形成重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；
C、为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，这样切割后得到的DNA片段两侧的黏性末端不同，C正确；
D、由于受体细胞为无任何抗药性的原核细胞，因此能在含青霉素的培养基中生长，可能是受体细胞成功导入了目的基因，也可能是只导入了不含目的基因的载体，D错误。
故选C。
3．下列关于基因表达载体的说法不正确的是（       ）
A．不同的目的基因所需的启动子不一定相同
B．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
C．终止子位于目的基因的尾端，能够终止翻译
D．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
【答案】C
【解析】
【分析】
基因表达载体的构建：
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用；
（2）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等。
【详解】
A、在细胞中基因会选择性表达，所以不同的目的基因所需的启动子不一定相同，A正确；
B、启动子是DNA上一段特殊的序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位，起始转录，B正确；
C、终止子位于目的基因的尾端，能够终止转录，C错误；
D、基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子与基因的表达直接相关，标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，D正确。
故选C。
4．人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，患者因缺乏hGC基因而不能合成hGC，导致脾脏肿大、梗死和破裂，所以通常活不过10岁。传统的治疗方法是从人的胎盘中提取hGC后注入人体，治疗价格十分昂贵。科学家现已将hGC基因通过农杆菌转化法成功转入烟草中，并高效表达，其过程如下图所示。下列说法正确的是（       ）

A．转化是指将hGC基因导入烟草细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
B．过程③一般采用显微注射将农杆菌导入烟草细胞
C．从含重组Ti质粒的农杆菌中获取hGC基因的表达产物可直接用于疾病治疗
D．从愈伤组织中提取蛋白质作为抗原进行抗原-抗体杂交检测hGC基因是否转录
【答案】A
【解析】
【分析】
题图分析，图中①是目的基因表达载体的构建，②是将重组质粒导入农杆菌，③利用农杆菌转化法侵染烟草细胞，④培养含有目的基因的烟草细胞进行脱分化获得愈伤组织。
【详解】
A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，故这里的转化是指将hGC基因导入烟草细胞，并且在烟草细胞内维持稳定和表达的过程的过程，A正确；
B、过程③一般采用含重组质粒的农杆菌感染烟草细胞，即农杆菌转化法实现将目的基因导入烟草细胞的过程，B错误；
C、应农杆菌属于原核生物，不含内质网和高尔基体，所表达的蛋白质还不具有相应的空间结构，没有活性，因此，从含重组Ti质粒的农杆菌中获取hGC基因的表达产物需加工后才可用于疾病治疗，C错误；
D、可从愈伤组织中提取蛋白质作为抗原进行抗原-抗体杂交检测hGC基因是否成功表达并翻译出蛋白质，D错误。
故选A。
5．下列关于利用乳腺生物反应器生产药用蛋白的叙述，正确的是（       ）
A．可以使用钙离子处理法将基因表达载体导入受体体细胞
B．相关目的基因需与能在乳腺细胞蛋白基因启动子等调控元件重组在一起
C．需要借助于核移植技术、早期胚胎培养和胚胎移植技术培育出转基因动物
D．药物的生产不会受到转基因动物性别和年龄的限制
【答案】B
【解析】
【分析】
基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】
A、乳腺生物反应器的受体是动物细胞，将目的基因倒入动物细胞的方法是显微注射法，A错误；
B、相关目的基因需与能在乳腺细胞蛋白基因启动子等调控元件重组在一起，才能使药用蛋白基因在奶牛乳腺细胞中特异性表达，B正确；
C、乳腺生物反应器的培育过程中不涉及核移植技术，C错误；
D、由于乳腺生物反应器需要利用动物产生的乳汁进行药物生产，故药物的生产受到转基因动物性别和年龄的限制，要求选择合适的雌性个体，D错误。
故选B。
6．科学家利用蛋白质工程技术将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了10~12℃。据分析，脯氨酸替代甘氨酸后，由于引入了一个吡咯环侧链，刚好填充于138位甘氨酸附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性，下列说法正确的是（       ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
C．蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质
D．经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传
【答案】C
【解析】
【分析】
蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。
【详解】
A、蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，A错误；
B、蛋白质工程要通过基因工程实施，需要酶和载体作为工具，B错误；
C、蛋白质工程的实质是定向改造或生产人类所需蛋白质，故蛋白质工程可以获得满足人类生产和生活需求的蛋白质，C正确；
D、蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，由于是对基因进行的改造，遗传物质已经改变，属于可以遗传的变异，D错误。
故选C。
7．枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，使其在pH=6时的活力提高了10倍。下列说法正确的是（       ）
A．需要通过改造基因实现对蛋白质中氨基酸的替换
B．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有独特的优势
C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传
D．蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息
【答案】A
【解析】
【分析】
蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
【详解】
A、氨基酸的的排列顺序是由基因决定的，因此完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现，A正确；
B、该成果培育了新品种，而不是新物种，B错误；
C、经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶的基因发生了改变，因此经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可以遗传，C错误；
D、蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，虽然合成了改造的基因，但它最终要达到的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求，D错误。
故选A。
8．现代生物技术发展迅猛，改变着人类的生产和生活方式，成为促进社会和经济发展的重要力量。生物技术在给人带来福音和便利的同时，对人类社会的安全性也产生了一定的影响。下列有关说法正确的是（       ）
A．转基因技术是提高生物多样性的一种重要手段
B．转基因抗虫植株可以减少农药的使用，因此对环境不会造成任何影响
C．克隆技术如果被不当利用将给社会造成灾难，应禁止任何克隆研究
D．转基因农作物对于解决粮食、能源等问题具有积极作用，但也存在一定风险
【答案】D
【解析】
【分析】
转基因生物的安全性问题：食物安全（滞后效应、过敏源、营养成分改变）、生物安全（对生物多样性的影响）、环境安全（对生态系统稳定性的影响）。
【详解】
A、生物多样性包括基因多样性、物种多样性和生态系统多样性，转基因技术实现了不同物种间基因的转移，但并未提高生物多样性，A错误；
B、种植转基因抗虫作物，可以减少农药的使用量，但可能会环境造成基因污染等，B错误；
C、克隆技术如果被不当利用将给社会造成灾难，应禁止生殖性克隆，但是不反对治疗性克隆，如治疗性克隆可用于治疗白血病等，C错误；
D、转基因农作物对于解决粮食、能源等问题起了积极作用，同时也存在着一定风险，如可能有滞后效应、出现过敏源、食物的营养成分改变等，D正确。
故选D。
9．西红柿怕冻，生活在寒带的比目鱼却因体内有一种抗冻蛋白质而不怕冻。科学家将比目鱼的抗冻蛋白质基因转移到西红柿里，培育出了抗冻西红柿。这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，一年四季都能获得西红柿。下图为培育转基因抗冻西红柿的过程示意图。据图回答下列问题：

(1)通过过程①可以构建该种比目鱼的__________文库。该文库与其基因组文库相比，基因的结构中缺少__________。
(2)过程②要用SmaⅠ限制酶切割抗冻蛋白质基因和质粒，所需的DNA连接酶是__________（“E·coli DNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
(3)过程②构建的重组质粒通过农杆菌的__________作用，使抗冻蛋白质基因进入西红柿组织细胞并插入到__________上，此过程有利于目的基因的__________。
(4)过程③④所属细胞工程技术及其原理是__________。
(5)针对转基因产品，我国制定了很多法规，既维护了消费者对转基因产品的__________的权利，又保证了转基因技术和已上市的产品的安全性。
【答案】(1)     cDNA     启动子、内含子
(2)T4DNA连接酶
(3)     转化     染色体DNA     遗传特性得以稳定维持和表达
(4)植物组织培养、植物细胞的全能性
(5)知情和选择
【解析】
【分析】
cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。
(1)
过程①是指mRNA逆转录得到cDNA，建立cDNA文库；由于转录而来的mRNA已经剪切掉了内含子对应的部分，且不包含启动子，因此cDNA文库比基因组文库缺少启动子、内含子。
(2)
既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是 T4DNA连接酶。
(3)
因为农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，如果将目的基因插入到T-DNA质粒上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
(4)
过程③④是利用离体的植物组织培养成完整植株的过程，属于植物组织培养技术，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。
(5)
基因工程育种与传统杂交育种相比，最显著的特点是能定向改变生物的遗传特性。我国制定很多保护转基因产品的法规，可以维护消费者对转基因产品的知情和选择的权利，又保证了转基因技术和已上市的产品的安全性。
【点睛】
本题主要考查基因工程的内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。
10．Ⅰ.有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以___________为唯一碳源的固体培养基中，从功能上讲，该培养基属于___________培养基。
(2)为了统计样品中活菌的数目，常采用的接种方法是___________。
(3)通常情况下，在微生物培养过程中，对培养基进行灭菌的方法是___________，对玻璃器皿常用的的灭菌方法是___________。
(4)如果培养的是硝化细菌，在没有氮源的培养基上___________（填“能够”或“不能”）生长，原因是___________。
Ⅱ.图示为应用生物工程获得人们需要的生物新品种或新产品的方案。请回答下列问题：

(5)方案Ⅰ中，通常利用Ti质粒将抗虫基因导入棉花受体细胞，此方法为了使抗虫基因顺利连接到受体染色体基因组中，抗虫基因通常位于Ti质粒的__________片段中。从分子水平检测抗虫棉是否培育成功的方法是：__________________________________。
(6)推测方案Ⅱ中prG基因最可能的作用是________________________。
(7)方案Ⅲ中的转抗血栓基因山羊可以通过分泌乳汁来生产抗血栓药物。在构建的相应基因表达载体中，抗血栓基因的首端必须含有使其仅能在山羊乳腺细胞中特异性表达的_____________，该调控元件的作用是______________________。
(8)方案Ⅲ中的早期胚胎在移植入受体母羊子宫之前，必须对胚胎进行性别鉴定，一般是取处于_______________时期的______________________细胞进行检测。
【答案】(1)     原油     选择
(2)稀释涂布平板法
(3)     湿热灭菌法     干热灭菌法
(4)     不能     硝化细菌无法利用空气中的氮气
(5)     T-DNA     抗原-抗体杂交法
(6)调控细胞（无限）增殖
(7)     启动子     提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因转录出
(8)     囊胚     滋养层
【解析】
【分析】
1、接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。接种的目的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细菌繁殖而成的子细胞群体—菌落。
2、分析题图：图示为应用生物工程获得人们需要的生物新品种或新产品的方案。方案Ⅰ采用了基因工程和植物组织培养技术；方案Ⅱ采用了基因工程和动物细胞培养技术；方案Ⅲ采用了基因工程及胚胎工程技术。
(1)
欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其它碳源，即接种于以原油为唯一碳源的固体培养基上，不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。
(2)
分离纯化菌种时，需采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，为了统计样品中活菌的数目，常采用的接种方法是稀释涂布平板法。
(3)
实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)、湿热灭菌(如培养基)等。
(4)
如果培养的是硝化细菌，在没有氮源的培养基上不能生长，这是因为硝化细菌无法利用空气中的氮气，缺乏氮源其将无法正常生长。
(5)
Ti质粒上有一段DNA叫做T-DNA，能进入受体细胞并且整合到受体细胞的染色体DNA上；检测目的基因是否翻译成蛋白质，通常采用抗原-抗体杂交法。
(6)
免疫过的B细胞能产生抗体，但不能在体外培养条件下无限增殖。由此可见，方案Ⅱ中prG基因最可能的作用是调控细胞(无限)增殖。
(7)
方案Ⅲ中的转抗血栓基因山羊可以通过分泌乳汁来生产抗血栓药物，此类转基因动物称为乳腺生物反应器在构建的相应基因表达载体时，需要在目的基因（抗血栓基因）前加入乳腺细胞特异性表达的启动子。启动子的作用是提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA。人们通常将此类转基因动物称为乳腺生物反应器。
(8)
对胚胎进行性别鉴定时，一般是取处于囊胚时期的滋养层细胞进行检测。

1.(2021山东高考 13)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ）
A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟
C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L
【答案】A
【解析】木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；
37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
2.（2021辽宁14） 腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（　　）
A. N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B. 加入连接肽需要通过改造基因实现
C. 获得N1的过程需要进行转录和翻译
D. 检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境
【答案】D
【解析】
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。
2、蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
3、蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；
B、蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；
C、N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；
D、酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。
故选D。
【点睛】
3.（2021北京14） 社会上流传着一些与生物有关的说法，有些有一定的科学依据，有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是（　　）
A. 长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素
B. 转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒
C. 消毒液能杀菌，可用来清除人体内新冠病毒
D. 如果孩子的血型和父母都不一样，肯定不是亲生的
【答案】A
【解析】
【分析】血型分为四种，即A，B，AB，O。血型是指红细胞上所含的抗原不同而言，红细胞上只含A抗原的称A型，含有B抗原的称B型，既有A抗原又有B抗原的称为AB型，既没有A抗原也没有B抗原的称为O型。ABO血型受ABO三种基因控制，A基因控制A抗原产生，B基因控制B抗原产生，O基因控制不产生A和B两种抗原，而基因都是成对存在，控制ABO血型的基因可有六种不同组合，即AA，AO，BB，BO，AB，OO，而每个人只有其中一对。
【详解】A、维生素会受到高温破坏，加热、光照、长时间储存等都会造成维生素的流失和分解，A正确；
B、转基因抗虫棉对非靶标生物无毒性，B错误；
C、消毒液只能杀死表面的病毒细菌，但无法清除体内的病毒，C错误；
D、如果孩子的血型和父母都不一样，也可能是亲生的，如A型血和B型血的父母也可以生出O型血的孩子，D错误。
故选A。
4.（2021海南25）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。

【答案】（1）DNA连接酶
（2）感受态细胞法
（3） 碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸序列
（4） DNA分子杂交技术 出现杂交带
（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【分析】
基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
（1）
基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
（2）
大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（3）
根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）
可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若出现杂交带，则说明基因敲除成功。
（5）
根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
【点睛】
本题以基因编辑技术为情境，考查DNA分子的结构、碱基互补配对、基因工程等相关知识，考查学生综合应用能力及科学思维的核心素养。
5.（2021天津16 ）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。


（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为___________。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑___________和___________。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有____________，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列___________（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在___________的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A. 进一步优化发酵条件 B. 使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C. 敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D. 对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】（1）细胞质基质
（2） ①. 包含BamHI的识别序列 ②. 将GTG改为ATG ③. 原核生物复制原点 ④. 不能 ⑤. 缺失尿嘧啶 （3）B
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。
【小问2详解】
①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。
②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。
【小问3详解】
A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；
B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；
C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；
D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。
故选B。
【点睛】本题以获得能产生乳酸的工程菌株为背景，考查基因工程的相关内容，重点考查基因表达载体的构建，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，识记PCR技术的原理和过程，能结合所学的知识准确答题。
6.（2021福建21） 微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
（1）根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为___________。

（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用___________酶将载体P切开，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因___________和___________。选用___________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用___________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
（3）MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是___________。

【答案】（1）引物1和引物4
（2） ①. EcoRV ②. T4DNA ③. 启动子 ④. 终止子 ⑤. XhoI和PstI ⑥. 钙
（3）尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【解析】
【分析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。
【小问2详解】
①为得到平末端，可用EcoRV酶将载体P切开；由于E·coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，结合题意可知，MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoI和PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。
【小问3详解】
由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，解答本题的关键是分析题图，明确基因工程的工具，并根据限制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列，结合题意明确检测基因表达载体的方法。
7.(2021山东高考 25)人类γ基因启动子上游调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是____，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是_____。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是____。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于_____，理由是___。
【答案】 ①. SalI ②. EcoRI ③. 6 ④. F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 ⑤. 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 ⑥. 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【解析】（1）据提意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子P的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
8.（2021北京16） 新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通过_______得到cDNA，经_______获取S基因，酶切后再连接到载体。
（2）重组疫苗中的S基因应编码________。
A. 病毒与细胞识别的蛋白 B. 与病毒核酸结合的蛋白
C. 催化病毒核酸复制的酶 D. 帮助病毒组装的蛋白
（3）为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→________→_________→诱发特异性免疫反应。
（4）重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因________。
【答案】（1） ①. 逆转录/反转录 ②. PCR扩增 （2）A
（3） ①. （重组腺病毒）进入细胞 ②. 表达抗原
（4）重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【解析】
【分析】重组腺病毒疫苗必须具备的条件：能够将新冠病毒抗原基因（目的基因）带入到受体细胞；在受体细胞中表达出抗原蛋白；不会导致疾病发生。
【小问1详解】
新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩增出目的基因——S基因，需要利用PCR扩增技术。
【小问2详解】
重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。
故选A。
【小问3详解】
重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。
【小问4详解】
接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
【点睛】本题以新冠肺炎为问题情境，考查重组腺病毒疫苗和免疫的相关知识，考查考生运用所学知识解决实际问题的能力。
9.（2021·全国甲卷高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】（1）④②③①
（2）Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 Taq酶从引物起始进行互补链的合成
（3）两条单链DNA
（4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【分析】
PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
【详解】
（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】
本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，以及在临床病原菌检测中的应用。
10．（2022年6月·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
(1)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。
(2)为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。
（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：
(4)在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。
(5)为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。
(6)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。
【答案】(1)     无菌水     水浴     杀死不耐热微生物
(2)     分离     KI-I2
(3)     人工诱变     原生质体融合
(4)     农杆菌     过低     敏感性
(5)     再生     细胞核     形态特征和数量
(6)     培养时间     受精卵
【解析】
【分析】
（一）选择培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率。
（二）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。转化过程：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
(1)
产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌水制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的水浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
(2)
将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
(3)
要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
(4)
野生的农杆菌没有抗性基因，用于转化植物细胞的农杆菌一般在其T—DNA中插入一种抗生素抗性基因。抗生素的作用是抑制细菌生长，农杆菌属于细菌，在其侵染植物过程中，可以用另一种抗生素抑制农杆菌的生长，从而达到在后续实验中消除转化植物细胞中农杆菌的作用。具有T-DNA中抗性基因的细胞能在含有相应抗生素的培养基上存活。当培养基中抗生素浓度过低时，很多没有抗性的细胞也存活下来，因此出现假阳性，故在转基因前要对受体进行抗生素的敏感性检测。
(5)
转基因植株要经过植物组织培育，要提高培育转基因植株的成功率，应该选再生能力和遗传稳定性较强的受体，这种受体全能性较高，能保持生物的性状。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞核形态是否改变进行判断，也可以直接在光学显微镜下观察分裂期染色体的形态特征和数量，分析染色体组型是否改变。
(6)
植物转基因受体全能性表达程度高低除了与受体基因型、培养环境、继代次数有关外，还与培养时间长短和受体的取材有关，受精卵是没分化的细胞，分裂和分化能力都很强，故受体为受精卵时全能性表达能力最高。
11．（2022年1月·浙江·高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：

(1)取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。
(2)红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。
(3)生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。
（二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
(4)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(5)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。
(6)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。
【答案】(1)     无菌水     活化     离心     破碎
(2)     其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小     70%乙醇溶液
(3)     灭菌     资源化
(4)     逆转录     核酸探针
(5)     抗原     载体     使腺病毒失去复制能力
(6)     脾     动物血清
【解析】
【分析】
1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
(1)
防止污染，洗菌苔可加适量的无菌水，制成菌悬液并培养，解除休眠获得活化菌种。红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、离心，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行破碎处理，使细胞内的红曲色素释放出来。
(2)
用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是其它色素对该波长光的吸收相对较少，干扰相对较小。由于提取红曲色素是用的70%乙醇溶液，故测定时需用70%乙醇溶液作空白对照。
(3)
生产上提取红曲色素后的残渣，经灭菌处理残渣后，作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和资源化处理。
(4)
RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(5)
腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。
(6)
单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。
【点睛】
本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论。
12．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_______、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______（填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是______。
【答案】(1)     两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对     5'端
(2)     在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。
     在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数
(3)     促进UBC与FLAG-P的结合     P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
(4)药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【解析】
【分析】
PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
(1)
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
(2)
融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(3)
①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
(4)
根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【点睛】
本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。