备课素材（知识点）：印迹技术及应用 高中生物学选择性必修三

这是一份备课素材（知识点）：印迹技术及应用 高中生物学选择性必修三，共4页。学案主要包含了DNA印迹技术，RNA印迹杂交，蛋白质印迹技术等内容，欢迎下载使用。

DNA印迹（DNA blt）是由Suthern首次应用，也称为Suthern blt。基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含DNA片段的凝胶放入变性溶液中变性，将NC膜放在胶上。随着缓冲液逐渐被胶和膜上覆盖的滤纸吸收，胶中的DNA转移到膜上。DNA分子越小，转移越快。转移后加热使DNA固定于NC膜上，用于杂交反应。
基本步骤：
（1）待测核酸样品的制备
通过裂解细胞、蛋白酶和RNA酶消化、酚/氯仿抽提（除去未消化的蛋白质）等步骤从细胞、组织中提取DNA，得到了DNA样本。接着根据需要选择核酸内切酶消化，将DNA切割成大小不同的片段。
（2）待测DNA样品的电泳分离
将DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳，对DNA片段分离。
（3）凝胶中核酸的变性
将凝胶放到碱溶液中浸泡，使双链DNA变性为单链，再进行蒸馏水漂洗和酸中和处理。
（4）Suthern 转膜
将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维膜（NC）上。注意保持膜上与凝胶中的DNA片段位置一致。
（5）Suthern 杂交
在与探针杂交前，必须进行预杂交。预杂交液就是不含探针的杂交液，用来封闭膜上非特异性的吸附位点。一般将滤膜放到预杂交液中温育4～6小时，加入探针进行杂交反应。杂交过夜，在较高温度下用盐溶液洗膜。只有探针和待测DNA序列高度匹配时，才能在高温低盐条件下结合。
（6）杂交结果的检测
Suther技术可以对特定基因进行定性定量分析，用于核酸的结构和功能研究。
二、RNA印迹杂交
Nrthern 印迹（RNA印迹）杂交是指将待测RNA变性并经过电泳分离后转移到膜上，与探针进行杂交，检测RNA的方法。
基本原理与DNA印迹一样，就是变性剂不一样，因为RNA怕被污染，所以整个实验过程需要注意无RNA酶处理。
生物为什么会这样或者那样？这种问题首先有一个统一的笼统回答——这样或那样有演化优势。
对一个细胞来说，外源核酸总是危险的，很可能抢占细胞内的生化机器为自身服务，导致细胞的生命活动出现不必要的浪费甚至最终崩溃死亡。所以细胞都有多种机制识别、无效化乃至降解外源核酸(虽然也并不是万无一失永远有效的……)。而相比较于DNA，RNA发挥效应太快太直接、危险更大，因此更需要被及时清除。所以能够合成RNase的细胞在竞争中会获得额外优势，甚至合成出来的RNase更稳定都很可能会带来额外的竞争优势，久而久之就变成大家都合成RNase、到处都是除不干净的RNase这种状况了……
另外，核苷酸从头合成实在太耗能太繁琐了，偏偏每多一个细胞就得多使用很多的核苷酸。能充分利用食物里的核苷酸同时保证安全是一举两得的事，那么消化系统的细胞/消化腺外分泌核酸酶可能也是很划算的。
然后，麻烦就更大了……暗示动物可以外分泌RNase（核糖核酸酶，水解RNA）
至于DNase相对比较少和不稳定，可能主要是因为真核细胞有了核膜分隔以后对外源DNA的敏感性降低，导致高稳定性的DNase演化压力没有那么大吧。回头去看看原核生物，那些DNase简直五花八门没眼看……奈何它们的细胞内没有物理分隔，DNase的特异性不能太差否则容易自戕（Zi qiang,自杀的意思），为了追求精准只有部分牺牲稳定性了。至于真核细胞合成的RNase们，反正自家RNA有修饰保护，最后就演化成了皮实耐造又没脑子(特异性)的“肌肉棒子”……真核细胞Rnase特异性低，在外界不需要辅助因子就能发挥作用嘎嘎乱切。
三、蛋白质印迹技术
蛋白质印迹技术（Western blt ）与前两者相似，所用的探针是抗体，所以也叫免疫印迹。
Western blt首先要将蛋白质通过聚丙烯凝胶电泳分开，再将蛋白质转移到NC膜，（与DNA/RNA不同，蛋白质转膜必须电转移）NC膜上的蛋白再与探针（抗体）杂交，再和被碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记的二抗结合，最后检测目的蛋白的有无和位置。
因此，Western blt 用于检测特异性蛋白质是否存在，并进行半定量分析。