高中生物人教版 (新课标)选修1《生物技术实践》课题3 血红蛋白的提取和分离学案

这是一份高中生物人教版 (新课标)选修1《生物技术实践》课题3 血红蛋白的提取和分离学案，共7页。学案主要包含了学习目标，自主预习，互动探究，课堂练习等内容，欢迎下载使用。

1．说出提取生物大分子的基本过程和方法；
2．知道色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
【自主预习】
一、蛋白质的分离原理
1．依据：蛋白质特性的差异
(1)分子形状和大小。
(2)溶解度。
(3)吸附性质。
(4)所带电荷的性质和多少。
(5)对其他分子的亲和力。
2．凝胶色谱法
(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据被分离蛋白质的相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。
(2)原理：大多数凝胶是由多糖类化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
(3)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖或琼脂糖。
3．缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
4．电泳
(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极移动。电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)分类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
二、实验操作
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤
采集血样→低速短时间离心→用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤→低速短时间离心→重复洗涤三次。
(2)血红蛋白的释放
红细胞eq \(――→,\s\up7(加入),\s\d5(！！！ 蒸馏水 ###))到原血液体积eq \(――→,\s\up7(加入),\s\d5(40%体积的甲苯))磁力搅拌器上搅拌eq \(――→,\s\up7(！！！ 10 min ###))血红蛋白释放
(3)分离血红蛋白溶液
将血红蛋白溶液离心→将试管中的液体用滤纸过滤→除去脂溶性沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分出下层的红色透明液体。
2．粗分离：即透析，取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mml/L的磷酸缓冲液中(pH为7．0)。
3．纯化：即样品的加入和洗脱
(1)调整缓冲液面：与凝胶面平齐。
(2)滴加透析后的样品：用量为1 mL，不要破坏凝胶面。
(3)打开下端的出口，使样品渗入凝胶床，样品完全进入凝胶层后关闭下端的出口。
(4)洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱，不能发生洗脱液流干现象。
(5)收集：待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。
4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
三、操作提示
1．红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。
3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
4．蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
【互动探究】
1．怎样判断是否完成了血液样品的处理？
2．随着人类跨入基因组和蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，人们首先要做到的第一步是什么？
3.你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？
【课堂练习】
1. 如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是______；乙装置中，C溶液的作用是________。
(3)甲装置用于________，目的是_________________________________。
用乙装置分离蛋白质的方法叫________，是根据________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
答案：(1)运输
(2)磷酸缓冲溶液 洗脱血红蛋白
(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小
(4)红色的蛋白质接近色谱柱的底端
2．下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理示意图，据图回答下列问题：
(1)图中A表示的含义：相对分子质量较小的蛋白质_________________________；相对分子质量较大的蛋白质__________________。
(2)图中B表示凝胶色谱法分离蛋白质的过程，指出图中①②③④⑤各自的含义：
①_________________________________。
②_________________________________。
③_________________________________。
④_________________________________。
⑤_________________________________。
答案：(1)由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留
被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过 (2)①蛋白质混合物上柱 ②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外 ③相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动 ④相对分子质量不同的分子完全分开
⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中